活死細胞染色試劑盒是Calcein-AM和PI 的雙重染料

產品說明：
Calcein-AM 是一種對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑，發綠色熒光（Ex=490nm, Em=515nm）。因其在傳統的 Calcein（鈣黃綠素）基礎上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基團，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細胞膜。一旦進入細胞后，Calcein-AM（本身不發熒光）被細胞內的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子 Calcein，從而被滯留在細胞內并發出強綠色熒光。與其它同類試劑（如 BCECF-AM 和 CFDA)相比，由于 Calcein, AM 細胞毒性極低，適合用于活細胞染色的熒光探針，而且不會抑制任何的細胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。
 

由于死細胞缺乏酯酶，Calcein-AM 僅用于對活細胞的細胞生存能力測試和短期標記。因此，
Calcein-AM 常常與死細胞熒光探針如碘化丙啶（PI）等聯合使用，同時進行活細胞和死細胞的熒光
雙重染色。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿過活細胞的細胞膜，僅能穿過死細胞膜的無序
區域而到達細胞核，并嵌入細胞的 DNA 雙螺旋從而產生紅色熒光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此
PI 僅對死細胞染色。由于 Calcein 和 PI-DNA 都可被 490 nm 激發，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活
細胞和死細胞。而用 545 nm 激發，僅可觀察到死細胞。
 

本試劑盒的工作原理就在于 Calcein-AM 和 PI 的雙重染料，來進行活細胞和死細胞的雙重染色
標記，從而進行活細胞和死細胞水平的分析。根據我司優化的實驗體系，單次就 200µl 細胞懸液進
行染色，可以做 500 次檢測。

染色步驟
2.1 對于貼壁細胞，先用細胞刮刀或者胰酶-EDTA 消化細胞，之后離心收集細胞（1000 rpm，3min）。
對于懸浮細胞，直接離心（1000 rpm，3min）收集細胞。
2.2 去上清，用 1×Assay Buffer 充分清洗細胞 2~3 次，以充分去除殘留的酯酶活性。
2.3 用 1×Assay Buffer 制備細胞懸液，使其密度為 1×105~1×106細胞/ml。
2.4 取 100µl 染色工作液加入 200µl 細胞懸液內，混勻，37℃孵育 15min。
注意：如果需要，可延長孵育時間至 30min。
2.5 熒光顯微鏡下使用 490±10 nm 激發濾片同時檢測活細胞（黃綠色熒光）以及死細胞（紅色熒光）。
另外，使用 545nm 的發射濾片僅能觀察到死細胞。也可以直接在熒光酶標儀下使用合適的濾片進行
檢測。
注意：可以使用以下方法來優化得到兩種熒光染料的工作濃度。
a) 用 0.1%皂素或者 0.1-0.5%孵育細胞 10min，或者用 70%乙醇孵育細胞 30min，從而制備死
細胞；
b) 用 0.1-10µM 的 PI 溶液進行死細胞染色，以得到僅僅對細胞核染色，而不會對細胞質染色的
工作濃度。
c) 用 0.1-10µM 的 Calcein-AM 進行死細胞染色，以得到不會對細胞質染色的工作濃度。然后用
此濃度進行活細胞染色，去觀察是否活細胞能被染色。
注意事項：
1）由于 Calcein-AM 對濕度非常敏感，若是 Calcein-AM 溶液每次取完需要量后，必須緊緊密封蓋
子。建議根據單次用量，分裝密封保存。Calcein-AM 工作液必須現配現用。
2）碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作時一定要注意防護。若接觸到皮膚，需要立即用自來水清
洗。
3）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。